Las translocasas de fosfato de undecaprenilo confieren aptitud microbiana condicional

Nature volumen 613, páginas 721–728 (2023)Cite este artículo

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La pared celular microbiana es esencial para el mantenimiento de la forma celular y la resistencia a factores estresantes externos1. El principal componente estructural de la pared celular es el peptidoglicano, un glicopolímero con entrecruzamientos peptídicos ubicado fuera de la membrana celular1. La biosíntesis y la estructura de los peptidoglicanos responden a condiciones ambientales cambiantes, como el pH y la salinidad2,3,4,5,6, pero los mecanismos subyacentes a tales adaptaciones no se comprenden completamente. Los precursores del peptidoglicano y otros glicopolímeros de la superficie celular se sintetizan en el citoplasma y luego se distribuyen a través de la membrana celular unidos al transportador lipídico reciclable undecaprenil fosfato7 (C55-P, también conocido como UndP). Aquí identificamos las familias de proteínas transmembrana que contienen DUF368 y DedA como translocasas C55-P candidatas, llenando un vacío crítico en el conocimiento de las proteínas necesarias para la biogénesis de los polímeros de la superficie celular microbiana. Las bacterias Gram negativas y Gram positivas que carecen de su proteína análoga que contiene DUF368 exhibieron defectos de viabilidad y pared celular dependientes de álcali, junto con niveles elevados de C55-P en la superficie celular. Las interacciones genéticas sintéticas dependientes del pH entre las proteínas que contienen DUF368 y los miembros de la familia DedA sugieren que el uso del transportador C55-P es dinámico y está modulado por aportes ambientales. El patógeno del cólera requería la actividad del transportador C55-P para el crecimiento y el mantenimiento de la forma de las células en el intestino. Proponemos que la dependencia del transportador condicional proporciona resiliencia en el reciclaje de los portadores de lípidos, reforzando la aptitud microbiana tanto dentro como fuera del huésped.

Los lípidos undecaprenilo (C55) fosforilados tienen un papel esencial como moléculas transportadoras reciclables en la biogénesis de glicopolímeros de la superficie celular microbiana. Durante la biosíntesis de peptidoglicano, las subunidades pentapeptídicas de peptidoglicano unidas a azúcar que se ensamblan en el citoplasma bacteriano se unen covalentemente a C55-P para el transporte transmembrana (Fig. 1a). Después de que MurJ8 mueve el precursor de peptidoglicano ligado al portador (lípido II) desde la valva interna a la externa de la membrana, la incorporación posterior del muropéptido en el peptidoglicano polimerizado deja pirofosfato C55 (C55-PP). El reciclaje del portador se inicia mediante la hidrólisis de C55-PP a C55-P mediante fosfatasas asociadas a membrana, incluidas UppP (también conocida como BacA) y las proteínas de dominio PAP2 PgpB, YbjG y LpxT7. Luego, presumiblemente, C55-P se devuelve a la cara citosólica de la membrana para completar el reciclaje. Los estudios estructurales preliminares han propuesto que UppP también puede funcionar como una translocasa de C55-P9,10, pero aún no se han identificado las proteínas responsables de la internalización de C55-P. El reciclaje de C55-P es un paso clave en la biosíntesis de peptidoglicano, así como de otros glicopolímeros de la superficie celular, incluidos los ácidos teicoicos de la pared, ciertas modificaciones de lipopolisacáridos y cápsulas7. Dado su papel fundamental y de amplio alcance en el mantenimiento de la superficie celular, el reciclaje de C55-P se considera un objetivo importante para las terapias antimicrobianas, y se han identificado antibióticos naturales que inhiben este proceso11.

a, Uso y reciclaje de C55-P en bacterias. Los sitios de acción antibiótica relevantes para la Fig. 3 se indican con barras rojas. Las flechas discontinuas representan múltiples pasos enzimáticos y/o de transporte. El hexágono gris representa azúcares variables unidos a C55-P para el ensamblaje de glicopolímeros aguas abajo. LPS, lipopolisacárido; PG, peptidoglicano. b, Conservación de DUF368 en filos bacterianos seleccionados (verticales) y géneros (cursiva). Los segmentos coloreados y las etiquetas asociadas indican filos seleccionados con una conservación sustancial de DUF368. Se indica la fracción de genomas de clado únicos secuenciados que codifican una proteína que contiene DUF368. c,d, Cinta prevista (c) y estructuras coloreadas de superficie electrostática (d) de VCA0040. Escala de colores, −10 a 10 kcal (mol e−). e, f, Crecimiento (e) y morfología (f) de V. cholerae de tipo salvaje (WT), Δvca0040 y Δvca0040 + vca0040 (cromosómicamente complementado) en medio LB. g, pH medio de cultivos LB de una noche de V. cholerae. h, crecimiento de V. cholerae en medio M9 tamponado al pH indicado. i, Los efectos del sobrenadante gastado tamponado (medio libre de células después de 24 h de crecimiento a 30 °C a partir de un cultivo 1:1000) sobre la morfología de V. cholerae en fase logarítmica. j, Los efectos del pH sobre el crecimiento de V. cholerae (arriba) y la morfología (abajo) durante la fase logarítmica en medio LB tamponado con Na2HPO4 50 mM. NB, medio sin búfer. e,g,h, Los datos son media ± sd de n = 3 cultivos por cepa o condición. f,i,j, Imágenes representativas de n = 3 cultivos por cepa o condición. Barras de escala, 3 μm (f) y 5 μm (i,j).

Vibrio cholerae, el agente causal gramnegativo de la enfermedad diarreica del cólera, está expuesto a cambios dramáticos en el pH y las concentraciones de iones cuando entra, transita y sale del tracto gastrointestinal del huésped. Una variedad de redes de detección y señalización permiten que V. cholerae se adapte a entornos cambiantes. Por ejemplo, el patógeno responde a la salinidad y el pH alterados utilizando una fuerza motriz de sodio (SMF) en lugar de una fuerza motriz de protones (PMF) para impulsar la secreción de proteínas y la motilidad dependiente de flagelos, y regular la expresión de genes de virulencia12,13. Se cree que la composición de peptidoglicanos de V. cholerae está influenciada por factores ambientales, pero se desconocen los efectos del pH en la biología de la pared celular de V. cholerae14.

Una reciente prueba de secuenciación de inserción de transposones in vivo para determinar los determinantes de la colonización intestinal en un aislado clínico contemporáneo de V. cholerae identificó numerosos genes que no estaban previamente vinculados a la patogénesis de V. cholerae, incluidos varios loci de función desconocida (Datos ampliados, figura 1a). Uno de estos genes, vca0040 (N900_RS14215), se seleccionó para estudios adicionales porque conjuntos de datos similares16,17,18 sugirieron un requisito universal para este locus en la colonización intestinal de V. cholerae. Se predice que VCA0040 será una proteína de membrana interna de múltiples pasos y contiene el dominio ampliamente conservado de función desconocida DUF368 (también conocido como PF04018) (Fig. 1b y Datos ampliados Fig. 1b-e). El modelo estructural predicho de VCA0040 tiene una supuesta hendidura grande, característica de dominios con actividad de unión y/o transporte de ligando (Fig. 1c, d y Datos ampliados, Fig. 2). Una cepa de V. cholerae que carecía de VCA0040 (Δvca0040) exhibió un defecto de crecimiento en fase estacionaria (Fig. 1e y Datos ampliados, Fig. 3a) que estuvo acompañado por un fenotipo de forma celular distinta, donde las células Δvca0040 se convirtieron en esferas grandes (Fig. 1f y Datos ampliados). Figuras 3b,c). Estos V. cholerae esféricos eran viables y dieron lugar a células hijas normales en forma de bastón (Datos ampliados, figura 3d).

Razonamos que un factor específico de la fase estacionaria podría estar desencadenando el defecto de forma en las células Δvca0040. En consecuencia, la exposición de células Δvca0040 en crecimiento exponencial a sobrenadantes gastados libres de células de cultivos en fase estacionaria indujo rápidamente la formación de esferas (Datos ampliados, figura 3e). Los factores termolábiles y de alto peso molecular, así como los d-aminoácidos, que modulan la composición de peptidoglicanos en fase estacionaria, se excluyeron como candidatos (Datos ampliados, figuras 3e, f). En cultivos de LB, la entrada de V. cholerae a la fase estacionaria se acompaña de la alcalinización de los medios (Fig. 1g). Dado que se observaron defectos de forma mínimos en medio M9 tamponado neutro (Datos ampliados, figura 3b), planteamos la hipótesis de que las células Δvca0040 eran sensibles a los alcalinos. La amortiguación del medio M9 a diferentes valores de pH reveló un defecto de crecimiento a pH 8, pero no a pH 6 o pH 7, y la acidificación del sobrenadante gastado libre de células eliminó el fenotipo de inducción de esfera (Fig. 1h, i). En LB tamponado, las células Δvca0040 exhibieron defectos de crecimiento y forma celular a un pH superior a 8, pero no a valores de pH de hasta 7 (Fig. 1j). Por lo tanto, la proteína VCA0040 que contiene DUF368 es necesaria para la integridad de la forma de las células de V. cholerae y su crecimiento en condiciones alcalinas.

Los dominios DUF368 se conservan casi universalmente en las Vibrionaceae y están presentes en miles de especies Gram-negativas, Gram-positivas y arqueas adicionales que habitan en una amplia gama de nichos (Tablas complementarias 1 y 2). La expresión heteróloga de homólogos DUF368 grampositivos (Staphylococcus aureus) o arqueales (Haloferax volcanii) complementó al menos parcialmente el defecto de crecimiento alcalino de las células Δvca0040 V. cholerae (Datos ampliados, Fig. 4a, b). Ambos homólogos mostraron una fuerte similitud estructural prevista con VCA0040, lo que sugiere que la función de la proteína que contiene DUF368 se conserva no solo entre especies Gram negativas y Gram positivas, sino también en todos los reinos microbianos (Datos ampliados, figura 2).

Dado que el peptidoglicano es necesario para mantener la forma de las células bacterianas, planteamos la hipótesis de que las funciones de DUF368 afectan la pared celular. El mutante Δvca0040 tenía entre 1,5 y 2 veces menos peptidoglicano que el tipo salvaje y modestos defectos de entrecruzamiento con acumulación concurrente del precursor de peptidoglicano UDP-N-acetilmuramil pentapéptido (UDP-M5), lo que sugiere un defecto de biosíntesis de peptidoglicano aguas arriba del cruce. vinculación (Fig. 2a, by Datos extendidos Fig. 4c – e). Estos fenotipos estaban presentes a pH neutro y se exacerbaron con la exposición a condiciones alcalinas. De acuerdo con la idea de que la función DUF368 está conservada, S. aureus que carece de SAOUHSC_00846 también tuvo un defecto de crecimiento alcalino, cantidad reducida de peptidoglicano, acumulación de UDP-M5 y disminución de la reticulación (Fig. 2c – e y Datos ampliados Fig. 4f, g ). A partir de estos datos llegamos a la conclusión de que las proteínas que contienen DUF368 son condicionalmente necesarias para mantener la producción y composición de peptidoglicano.

a, b, peptidoglicano total (a) y UDP-M5 intracelular (b) en V. cholerae cultivado en medio mínimo M63 al pH indicado. Supresor, Δvca0040/ΔsecDF1. c, Crecimiento alcalino de ΔSAOUHSC_00846 (Δ0846) S. aureus en las condiciones indicadas y con los vectores de expresión indicados. Resultados representativos de n = 3 experimentos independientes por condición. d, e, peptidoglicano total (d) y UDP-M5 intracelular (e) en S. aureus cultivado en caldo de soja tríptico (TSB) con bicina 100 mM al pH indicado. a,b,d,e, n = 3 cultivos por cepa o condición; los datos son media ± sd a,b, ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. d,e, prueba t de Student de dos colas no apareada.

Dos observaciones adicionales centraron nuestra investigación de los dominios DUF368 en el ensamblaje de la pared celular. Primero, observamos que aunque la mayoría de las proteínas que contienen DUF368 constan principalmente de uno o dos dominios DUF368, varios microorganismos codifican proteínas de doble dominio con arquitecturas DUF368-PAP2, PAP2-DUF368 o DUF368-BacA (Tabla complementaria 3). En segundo lugar, durante la formación de esferas en Δvca0040 V. cholerae, hubo una inducción aproximadamente diez veces mayor de pgpB, que codifica una fosfatasa C55-PP20 (datos ampliados, figuras 5a-d y tabla complementaria 4). A pesar de estas asociaciones de DUF368 con procesos relacionados con C55, el mutante Δvca0040 mostró solo aumentos menores (hasta 4x) en las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) de una serie de antibióticos dirigidos a peptidoglicanos, probablemente porque la mayoría de los compuestos que actúan en la pared celular no pueden penetrar. la membrana externa Gram-negativa (Tabla complementaria 5). En consecuencia, la detección de MIC en S. aureus reveló que el mutante ΔSAOUHSC_00846 era mucho más sensible (más de 64 ×) a la anfomicina que el tipo salvaje en condiciones alcalinas (Fig. 3a y Tabla complementaria 5). La anfomicina es un antibiótico lipopéptido dependiente de Ca2+ que se une específicamente a C55-P en la valva externa de la membrana citoplasmática e inhibe su reciclaje21,22,23 (Fig. 1a). De acuerdo con nuestros datos anteriores (Fig. 2d, e), se sabe que la anfomicina induce la acumulación de UDP-M5 y disminuye el entrecruzamiento de peptidoglicano en S. aureus24. El mutante ΔSAOUHSC_00846 también estaba moderadamente sensibilizado a la tunicamicina, que inhibe los primeros pasos comprometidos y dependientes de C55-P de la síntesis de ácido teicoico y peptidoglicano de la pared, así como a la bacitracina, que se une a C55-PP y previene la generación de C55-P en la cara extracitosólica de la membrana25,26 (Figs. 1a y 3a). Las CMI para otras moléculas dirigidas a peptidoglicanos, como la fosfomicina, cambiaron mínimamente (Fig. 3a y Tabla complementaria 5). Para probar la función de DUF368 en un organismo Gram-negativo, expresamos heterólogamente SAOUHSC_00846 o vca0040 en la cepa de Escherichia coli lptD421327, permeable a la membrana externa y, por lo tanto, sensibilizada a la anfomicina (Tabla complementaria 5). La expresión de cualquiera de las proteínas que contiene DUF368 en lptd4213 E. coli confirió resistencia a la anfomicina (Tabla complementaria 5). Dado que E. coli carece de una proteína endógena que contenga DUF368, este resultado indica que la función DUF368 es suficiente para la resistencia a un antibiótico dirigido a la superficie C55-P.

a, Cambio de veces (FC) en MIC para ΔSAOUHSC_00846 S. aureus en las condiciones indicadas. Anfomicina*, anfomicina con CaCl2 1 mM. b, Trazas de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) de estándares purificados C55-OH (a) y C55-P (b) (arriba), extractos de lípidos de S. aureus de tipo salvaje enriquecidos con cada estándar (centro) o de tipo salvaje. S. aureus tratado con 50 μg ml-1 de anfomicina (abajo). Rt, tiempo de retención. c, trazas de UPLC de extractos lipídicos de S. aureus de tipo salvaje o mutante cultivados en TSB pH 7 (arriba) o pH 8,5 (abajo). d,e, Abundancia relativa de C55-OH (d) y C55-P (e) en las mismas condiciones que en c. f, traza UPLC de extractos lipídicos de ΔSAOUHSC_00846 S. aureus complementado cultivado en TSB pH 8,5. g,h, proporciones máximas brutas de C55-OH (g) y C55-P (h) en cada cepa cultivada a pH 8,5. i, S. aureus teñido con anfo-FL a pH 8,5. Barras de escala, 5 μm. DIC, imagen de contraste de interferencia diferencial. j, Cuantificación de la señal anfo-FL. Los símbolos representan la intensidad media de anfo-FL de 1 a 8 grupos bacterianos individuales en cultivos independientes. k, Modelo propuesto de reciclaje interrumpido de C55-P y las consecuencias asociadas en bacterias que carecen de actividad translocasa C55-P. b,c,f,i, Datos representativos de n = 3 cultivos por cepa o condición. d,e,g,h,j, Los datos son media ± sd de n = 3–5 cultivos por cepa o condición. Cada punto es una cultura independiente. d,e, Prueba t de dos colas de Student no apareada. g,h,j, ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Los datos de composición de peptidoglicano y susceptibilidad a los antibióticos sugirieron indirectamente que el reciclaje de C55-P estaba afectado en el mutante ΔSAOUHSC_00846, específicamente en la reinternalización de C55-P. Para investigar más a fondo esta idea, cuantificamos las especies C55 en extractos de lípidos de membrana de cultivos de tipo salvaje y ΔSAOUHSC_00846. El tratamiento con anfomicina de S. aureus de tipo salvaje provocó una marcada acumulación tanto de C55-P como del precursor C55-OH28 restringido a grampositivos C55-P (undecaprenol, también conocido como UndOH) (Fig. 3b). Este fenotipo se replicó en células ΔSAOUSHC_00846 S. aureus cultivadas en medios alcalinos, pero no en condiciones neutras (Fig. 3c – e) o en una cepa complementada (Fig. 3f – h), lo que proporciona evidencia directa de que la homeostasis de C55-P está relacionada a SAOUSHC_00846. También observamos aumentos similares dependientes de alcalinos en C55-P (pero no en C55-OH) en Δvca0040 V. cholerae (Datos ampliados, Fig. 5e, f). Para cuantificar específicamente C55-P en la valva externa de la membrana celular, sintetizamos anfomicina conjugada con fluoresceína (anfo-FL) y la usamos para marcar células bacterianas vivas29. ΔSAOUHSC_00846 S. aureus marcado con Ampho-FL mostró una mayor señal en relación con las bacterias de tipo salvaje en medios alcalinos, lo que demuestra que los niveles de C55-P en la superficie están condicionalmente elevados en el mutante (Fig. 3i, j y Datos ampliados Fig. 5g, h) . En conjunto, estas observaciones sugieren que la acumulación alcalina de C55-P superficial en mutantes proteicos que contienen DUF368 provoca un aumento compensatorio, pero en última instancia insuficiente, en la síntesis de C55-P, lo que resulta en defectos de producción de glicopolímeros superficiales y un crecimiento deficiente (Fig. 3k). Estos hallazgos son consistentes con un modelo en el que las proteínas que contienen DUF368 son transportadores de reciclaje de C55-P que están activos en condiciones alcalinas.

Como se cree que el reciclaje de C55-P es una función esencial y los mutantes DUF368 eran condicionalmente viables, a continuación llevamos a cabo una selección de transposones sintéticos para definir la red genética de vca0040. Muchas de las interacciones sintéticas enfermas o letales identificadas estaban relacionadas con la homeostasis de la envoltura celular (Fig. 4a y Tabla complementaria 6). La interacción más fuerte de vca0040 fue con N900_RS16280 (también conocido como vca0534), que codifica un homólogo del miembro de la familia DedA de E. coli, YghB (Fig. 4b). V. cholerae expresa otras dos proteínas DedA, pero no aparecieron en esta pantalla. Las proteínas transmembrana de la familia DedA (también conocidas como PF09335 (proteína de Golgi asociada a SNARE)) se conservan en los tres dominios de la vida, generalmente son necesarias para la homeostasis de la envoltura celular y se sospecha que median el transporte dependiente de PMF, pero se desconocen sus sustratos específicos30 ,31. De manera similar a DUF368, aunque la mayoría de las secuencias que contienen DedA codifican solo ese dominio, hay muchos casos de arquitecturas de dominio en las que DedA se fusiona con el dominio de fosfatasa C55-PP PAP2 (Tabla complementaria 3). La letalidad sintética de vca0040 e yghB se validó mediante agotamiento genético y detección de transposones sintéticos recíprocos (Fig. 4c, Datos ampliados, Fig. 6a y Tabla complementaria 7), y la sobreexpresión de YghB rescató el defecto alcalino de Δvca0040 V. cholerae (Datos ampliados, Fig. .6b).

a, Una pantalla de transposón sintético en Δvca0040 V. cholerae, que muestra cambios medios de lectura en log2 (MFC; umbral ±2) y valores P inversos de la prueba U de Mann-Whitney (umbral 100). Datos agrupados de dos bibliotecas de transposones independientes. b, Contenido del dominio y estructura prevista de V. cholerae VCA0534 (también conocido como YghB). c, Crecimiento de cepas de agotamiento de ΔyghB V. cholerae vca0040. Ara, arabinosa; Glc, glucosa. d, Los supresores espontáneos de ΔSAOUHSC_00846 se asignan a dos proteínas de la familia DedA de S. aureus, con estructuras predichas (derecha) y mutaciones promotoras específicas seleccionadas para validación (en negrita). e, Rescate de ΔSAOUHSC_00846 mediante la expresión de SAOUHSC_00901 (0901) o SAOUHSC_2816 (2816) de promotores híbridos que contienen el promotor Pspac inducible por IPTG unido a tramos de promotor nativo de 25 pb (construcción 1) o 200 pb (construcción 2) con el indicado mutaciones supresoras (*). f, Cambio en veces en la CIM de anfomicina para S. aureus de tipo salvaje y mutante en relación con la CIM para el tipo salvaje a pH 7 (150 μg ml-1). c,e, Resultados representativos de n = 3 experimentos independientes por condición. f, Los datos son media ± sd de n = 3 cultivos por cepa o condición.

También se observaron interacciones entre las proteínas DUF368 y DedA en S. aureus. En los supresores espontáneos enriquecidos con alcalinos de ΔSAOUHSC_00846 S. aureus, encontramos mutaciones frecuentes en el promotor (y sin región codificante) en los genes que codifican las dos proteínas DedA de S. aureus (SAOUHSC_00901 y SAOUHSC_02816) (Fig. 4d). La incorporación de estas mutaciones en un sistema inducible por isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) que expresa la proteína DedA rescató ΔSAOUHSC_00846 incluso sin inducción, lo que sugiere que las mutaciones aisladas aumentan la expresión genética y compensan la ausencia de SAOUHSC_00846, como en V. cholerae. (Figura 4e). Estos estudios genéticos sugieren que los miembros de la familia DedA también son necesarios para la translocación de C55-P, de acuerdo con informes recientes de que las proteínas DedA eucarióticas están asociadas con el transporte de lípidos y los mutantes bacterianos de DedA son defectuosos en las modificaciones de lipopolisacáridos dependientes del portador C5531,32,33.

Nuestra hipótesis es que, de manera similar a las proteínas que contienen DUF368, los miembros de la familia DedA funcionan de manera condicional. Aunque la eliminación de SAOUHSC_00901 no afectó las CIM de anfomicina, el mutante ΔSAOUHSC_02816 exhibió una sensibilidad moderada a la anfomicina dependiente de ácido, fortaleciendo la asociación de los miembros de la familia DedA con la translocación C55-P y sugiriendo que funcionan en rangos de pH más bajos que sus contrapartes que contienen DUF368 (Fig. .4f). La sensibilidad de ΔSAOUHSC_02816 a otros antibióticos no se modificó en ningún pH, lo que destaca la especificidad de la sensibilización condicional a anfomicina (Tabla complementaria 5). El concepto de contribuciones de translocasas dependientes del pH también está respaldado por la sensibilidad a la anfomicina alcalina de lptd4213 E. coli, que solo tiene parálogos de DedA y ninguna proteína afín que contenga DUF368 (Tabla complementaria 5). Una cepa que carecía de yghB y vca0040 era viable a pH ácido, lo que sugiere que al menos otra proteína de V. cholerae puede realizar la translocación de C55-P, o que C55-P puede atravesar espontáneamente la membrana en condiciones ácidas (Datos ampliados, figura 6c).

Los análisis de supresores espontáneos de Δvca0040 V. cholerae, que tienen una morfología de colonia distintiva (Datos ampliados, Fig. 7a) revelaron que el requisito de VCA0040 para la aptitud de V. cholerae está controlado por la concentración de Na+ además del pH. La secuenciación del genoma completo de colonias supresoras que carecen de defectos en la forma celular reveló cuatro genes supresores, tres de los cuales (secD1, secF1 y ppiD) funcionan en la secreción de proteínas mediada por Sec (Datos ampliados, figura 7b). El cuarto, yfgO, codifica una proteína de función desconocida de la familia de transportadores AI-2E, cuyos miembros han sido implicados recientemente en la biosíntesis de peptidoglicano y en el antipuerto Na+/H+34,35. Las eliminaciones de genes supresores rescataron la forma y los defectos de peptidoglicano de Δvca0040 V. cholerae, a pesar de que el pH del cultivo estacionario era alcalino en todos los supresores (Fig. 2a, by Datos ampliados Fig. 7c, d). En V. cholerae, SecD-SecF se duplica como SecD1-SecF1 y SecD2-SecF2, complejos auxiliares que acoplan diferencialmente la actividad de SecYEG a SMF o PMF, respectivamente (Datos ampliados, Fig. 7e). La actividad de al menos un par SecD-SecF era necesaria para la viabilidad de V. cholerae, y la eliminación de secD2 y secF2 no mejoró el defecto de forma celular en fase estacionaria de Δvca0040 (Datos ampliados, Fig. 7c, f, g). Inicialmente planteamos la hipótesis de que la especificidad alterada del sustrato Sec podría explicar la identificación de SecD1 y SecF1 como supresores. Sin embargo, el proteoma ΔsecDF1 de V. cholerae no cambió con respecto al de las células de tipo salvaje, aparte de los aumentos esperados en SecD2 y SecF2, lo que sugiere que los efectos supresores de la pérdida de secD1 y secF1 fueron atribuibles a la reducción del flujo de Na+ (Datos ampliados, Fig. 7h). y cuadro complementario 8). De hecho, el aumento de la concentración de Na + pero no de K + indujo crecimiento alcalino y defectos de peptidoglicano en Δvca0040 V. cholerae (Fig. 2a, by Datos ampliados Fig. 7i-k). El requisito de una mayor concentración de Na + para el defecto alcalino de V. cholerae deficiente en DUF368 parecía ser específico de la especie, ya que ΔSAOUHSC_00846 S. aureus, aunque sensible a los alcalinos, no fue rescatado de manera similar por el agotamiento de Na + (Fig. 2c). Es de destacar que, a diferencia de Δvca0040, un mutante ΔyghB V. cholerae no pudo crecer sin Na+ a valores de pH superiores a 6 (Datos ampliados, Fig. 7l, m), lo que sugiere que la presencia de Na+ afecta de manera divergente a distintas translocasas C55-P. En conjunto, estos datos ilustran que múltiples aportes ambientales pueden controlar los requisitos de translocasa C55-P y potencialmente funcionar en diferentes microorganismos.

Utilizamos un modelo de conejo infantil (día posnatal (P) 1 – P2) que imita el cólera humano grave37 para investigar el papel de VCA0040 en la patogénesis. Normalmente, este modelo utiliza inóculos alcalinos para amortiguar el ambiente ácido del estómago. Para excluir los efectos del inóculo, llevamos a cabo infecciones mixtas con inóculos que comprenden una mezcla 1: 1 de tipo salvaje y Δvca0040 V. cholerae a pH 7 o pH 9 (Fig. 5a). Independientemente del pH del inóculo, el mutante Δvca0040 tenía un profundo defecto competitivo (100–1000x) en comparación con el tipo salvaje (Fig. 5b). El pH del inóculo no afectó la colonización total ni la acumulación de líquido cecal similar a la diarrea, el principal marcador de enfermedad en este modelo (Datos ampliados, Fig. 8a, b). En infecciones únicas con V. cholerae fluorescente de tipo salvaje o Δvca0040, el mutante exhibió defectos de colonización graves (alrededor de 1000 veces) en todos los segmentos intestinales (Fig. 5c, d). Estos valores sobreestiman la verdadera colonización del mutante, porque los conejos de cada grupo se alojaron conjuntamente para excluir los efectos de la camada, lo que permitió una transmisión sustancial de conejos infectados de tipo salvaje a conejos infectados con Δvca0040 (Datos ampliados, figura 8c). La transmisión probablemente explica por qué la acumulación de líquido cecal en conejos infectados con Δvca0040 fue menor que en conejos de tipo salvaje, pero no alcanzó significación estadística (Fig. 5e). El líquido cecal recolectado de animales infectados tanto mixtos como individualmente era fuertemente alcalino (pH 8,5–9) (Fig. 5f). Las imágenes de muestras de líquido cecal de conejos infectados con Δvca0040 revelaron células esféricas, fluorescentes y grandes similares a las observadas en cultivos alcalinos del mutante Δvca0040 (Datos ampliados, figura 8d). De manera similar, cuando se incubaron V. cholerae de tipo salvaje con forma de bastón recién cultivado o Δvca0040 en muestras de líquido cecal sin células. Las células Δvca0040, pero no las de tipo salvaje, se volvieron esféricas cuando se expusieron al líquido cecal, lo que sugiere que la función VCA0040 es necesaria para mantener la forma de V. cholerae en el medio alcalino in vivo (Fig. 5g). No se detectó un defecto de infección para ΔSAOUHSC_00846 S. aureus en un modelo de absceso de órgano e infección intravenosa en ratón, en el que es poco probable que el patógeno encuentre ambientes alcalinos (Datos ampliados, figura 9).

a,b, Esquema (a) e índices competitivos intestinales (b) en modelos de infección mixta (n = 6 conejos en cada grupo). SI, intestino delgado. c – e, esquema (c), número de unidades formadoras de colonias intestinales (UFC) (d) y relación de acumulación de líquido (FAR) (e) en infecciones individuales (n = 3 conejos (tipo salvaje) y n = 8 conejos ( Δvca0040)). FQ, líquido cecal; pSI, intestino delgado proximal; mSI, intestino delgado medial; dSI, intestino delgado distal. Los círculos abiertos indican conejos con mediciones del límite de detección (LOD) donde la carga real de UFC es al menos (para los círculos LOD superiores) o como máximo (para los círculos LOD inferiores) el valor trazado. Tenga en cuenta que dos animales Δvca0040 tuvieron una acumulación insuficiente de líquido cecal para el cálculo FAR y se les asignaron valores LOD (volumen arbitrario de 25 μl). b,d, Los datos son media geométrica. d, Pruebas U de Mann-Whitney de dos colas. e, Los datos son media ± SD analizados con una prueba t de Student de dos colas no apareada. f, pH del líquido cecal de animales infectados. Los datos son media ± sd g, incubación de V. cholerae cultivada en laboratorio con muestras de líquido cecal filtrado de tres conejos diferentes. Imágenes representativas de n = 3 incubaciones ex vivo con muestras de líquido cecal independientes. Barras de escala, 3 μm. h, Modelo propuesto para la translocación microbiana de C55-P y su control integrado mediante aportes ambientales, la presencia de otras translocasas y mecanismos de adaptación ambiental no relacionados con las translocasas.

Datos fuente

Proponemos que las proteínas de la familia DedA y que contienen DUF368 son translocasas C55-P que proporcionan resiliencia funcional en este paso crucial del mantenimiento de la envoltura (Fig. 5h). La identificación de las proteínas de transporte C55-P llena provisionalmente un vacío importante en la ruta de reciclaje del portador de lípidos C55. Como nuestros datos genéticos y fenotípicos no excluyen definitivamente las actividades independientes del transporte, se requieren estudios bioquímicos y estructurales para confirmar si estas dos familias realmente llevan a cabo esta función. La aparente dependencia del pH y los iones de las contribuciones de estas translocasas candidatas a la aptitud sugiere que estas proteínas podrían controlarse energéticamente, ya que un efecto importante del pH en la célula microbiana es la gobernanza de los gradientes iónicos transmembrana. Por ejemplo, las proteínas que contienen DUF368 parecen contribuir más en condiciones alcalinas donde el PMF es bajo, lo que sugiere que si la translocación de C55-P depende de la energía, el transporte mediado por DUF368 puede depender del SMF u otro gradiente de energía que no sea PMF. También es posible que los estados de protonación de C55-P, que probablemente dependen del pH, determinen la translocasa máximamente activa o la contribución potencial de la codificación espontánea de C55-P. Caracterizar la posible dependencia energética y la direccionalidad de múltiples translocasas C55-P será un tema importante de estudios futuros.

La condicionalidad de las proteínas de la familia DedA y que contienen DUF368, y quizás translocasas adicionales aún no identificadas, podrían respaldar el flujo de C55-P en diversos nichos microbianos (Fig. 5h). La sensibilidad de Δvca0040 V. cholerae al aumento de la concentración de iones de sodio y el aparente enriquecimiento de DUF368 en otros halófilos conocidos como S. aureus y la clase de arqueas Halobacteria (incluida H. volcanii) sugiere que, independientemente de su aporte energético, las proteínas que contienen DUF368 puede facilitar la adaptación microbiana a ambientes con alto contenido de sal (Tabla complementaria 1). Específicamente, la dependencia del sodio y el pH de la contribución de VCA0040 a la fisiología de V. cholerae puede reflejar la sólida capacidad del patógeno del cólera para colonizar el intestino delgado humano, donde es probable que se produzcan condiciones alcalinas y concentraciones de sodio en escala milimolar39. Además de la conservación variable de translocasas redundantes (Datos ampliados, figura 10a y tabla complementaria 9), es probable que los insumos adicionales y los mecanismos de adaptación también determinen cómo el reciclaje de C55-P contribuye a la aptitud microbiana. Por ejemplo, aunque vca0040 sólo se requiere en condiciones alcalinas en V. cholerae, este gen es esencial en el patógeno relacionado Vibrio parahaemolyticus incluso a pH neutro, a pesar de la conservación de yghB y loci supresores, lo que sugiere que el punto de ajuste del pH en el que se activa la actividad de la familia DUF368 es dominante no es universal40 (Datos ampliados, figura 10b). Aunque las proteínas que contienen DUF368, que han sido rebautizadas como proteínas transportadoras de poliprenilfosfato (PopT) en un trabajo publicado al mismo tiempo41, están restringidas a bacterias y arqueas, los miembros de la familia DedA están ampliamente presentes en eucariotas, incluidos los humanos. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden afectar la comprensión de la translocación del poliprenilfosfato (por ejemplo, dolicolfosfato) en todos los reinos de la vida.

Todas las cepas de V. cholerae utilizadas en este estudio son derivados de HaitiWT, una variante espontánea resistente a la estreptomicina de un aislado clínico de la epidemia de cólera de Haití de 201042. Todas las cepas de S. aureus utilizadas en este estudio son derivados de HG003 (en sí mismo un derivado de NCTC8325). La información sobre cepas y plásmidos se incluye en la Tabla complementaria 10. Todas las cepas construidas se verificaron mediante secuenciación de Sanger del locus objetivo (Genewiz).

En este estudio se utilizaron los siguientes medios: caldo de lisogenia (LB) Miller (10 g l-1 NaCl) (BD Biosciences, EE. UU.), medio mínimo M9 (12,8 g l-1 Na2HPO4·7H2O, 3 g l-1 KH2PO4, 0,5 g l- 1 NaCl, 1 g l-1 NH4Cl, 1 mM MgSO4 y 10 µM CaCl2) (fabricado en laboratorio), medio mínimo M63 (2 g l-1 (NH4)2SO4, 13,6 g l-1 KH2PO4, 0,5 mg l-1 FeSO4·7H2O y MgSO4 1 mM) (US Biologicals), TSB y agar de soja tríptico (TSA) (BD Biosciences). M9 se complementó con glucosa al 0,4% y se ajustó el pH con NaOH. M63 se complementó con glucosa al 2% y se ajustó el pH con KOH. En general, LB se tamponó con Na2HPO4 50 mM o Tris 100 mM y se ajustó el pH con NaOH o HCl, y TSB se tamponó con bicina 100 mM. Las variaciones en el almacenamiento en búfer se indican en las leyendas de las figuras. Las placas se utilizaron con una concentración final de agar del 1,5%. Cuando fue necesario, se utilizaron los siguientes antibióticos o suplementos: estreptomicina (200 μg ml-1), carbenicilina (50 μg ml-1), kanamicina (50 μg ml-1), neomicina (50 ug ml-1), targocilo (10 μg ml-1), eritromicina (10 μg ml-1), ácido diaminopimélico (DAP, 0,3 mM), 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-d-galactopiranósido (X-gal, 60 µg ml-1 ), arabinosa (0,2%) o IPTG (1 mM).

Para el cultivo de rutina, V. cholerae se cultivó en LB sin tampón a 37 °C y S. aureus se cultivó en TSB sin tampón a 37 °C. Los cultivos para el análisis del sobrenadante gastado en V. cholerae se obtuvieron subcultivando cultivos cultivados durante la noche a 37 °C 1:1000 en medios frescos y creciendo durante 24 h a 30 °C. Para recolectar los sobrenadantes gastados, los cultivos se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 g a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo, se volvieron a centrifugar y se filtraron de forma estéril con filtros de jeringa de 0,22 µm en tubos nuevos. Los sobrenadantes se almacenaron a 4 °C para uso futuro. Los cultivos utilizados para la cuantificación del pH se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 g antes de la medición. Todas las mediciones de pH, incluidas las de medios y formulación de tampón, se realizaron con un medidor de pH (Thermo ORION) recién calibrado con dos estándares de pH apropiados de 4, 7 y 10.

La información sobre los loci, genomas y números de acceso de genes y proteínas de este estudio está disponible en la Tabla complementaria 10.

Durante nuestro estudio, que utilizó principalmente una cepa pandémica contemporánea de V. cholerae (HaitiWT, también conocida como KW3, acceso de ensamblaje GCA_001318185.1), notamos varias inconsistencias en las anotaciones con genes aparentemente conservados en el ensamblaje de escopeta de referencia (GCA_000006745.1) de N16961 V. cholerae. En comparación con los ensamblajes de lectura larga más nuevos (GCA_003063785.1 y GCA_900205735.1), el ensamblaje original de N16961 tiene ~50 ORF más anotados como pseudogenes debido a cambios de marco que no están incluidos en las tablas de secuencias de codificación. Tres de ellos estaban directamente relacionados con nuestro estudio: (1) lacZ, un gen informador ampliamente utilizado (VC2338), (2) secF2 (VCA0692) y (3) yghB (VCA0534). Se sabe que lacZ es funcional en N16961, y la resecuenciación de nuestro stock de N16961 de laboratorio y el examen de ensamblajes de N16961 más nuevos confirmaron que secF2 e yghB de hecho están intactos en esta cepa y carecen del cambio de marco previsto. La anotación 'pseudogénica' de secF2 condujo a su uso reciente como un lugar seguro para la edición del genoma en V. cholerae43, y probablemente se requiera precaución con este método. Para resolver los problemas de diferencia entre los genomas de las cepas, en la Tabla complementaria 11 se proporciona un diccionario BLAST por lotes que asigna etiquetas de locus VC putativas (el sistema convencional de denominación de genes de V. cholerae) a loci HaitiWT anotados.

Para identificar secuencias con dominios DUF368 anotados, se utilizó Annotree44 con el identificador Pfam PF04018 con un valor e de corte de 1x10-30. Los resultados de esta búsqueda se incluyen en la Tabla complementaria 1. Los taxones con nombres '_X' se recopilaron manualmente en un solo grupo para facilitar el análisis. En un esfuerzo relacionado, para identificar homólogos de vca0040 independientes de la anotación, utilizamos una búsqueda HMMER con la secuencia VCA0040 de V. cholerae de tipo salvaje (Tabla complementaria 2). Para analizar las distribuciones relativas de PF04018, PF09335 (DedA) y PF02673 (BacA), utilizamos Annotree con un valor e de corte de 1 × 10−15. Las listas de especies diferenciales con todas las combinaciones de conservación posibles se visualizaron con un generador de diagramas de Venn (https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) y se proporcionan en la Tabla complementaria 9.

Para evaluar la arquitectura del dominio, utilizamos InterProScan (https://www.ebi.ac.uk/interpro) con DUF368 (PF04018) o DedA (PF09335) como consultas y examinamos manualmente las estructuras de dominio identificadas. Las secuencias con arquitecturas de dominio relevantes para este estudio se exportaron y recopilaron en la Tabla complementaria 3.

La predicción estructural de las proteínas de la familia DUF368 y DedA en este estudio se realizó con AlphaFold2 en la interfaz de acceso público CoLabFold45. Las secuencias se modelaron como monómeros utilizando mmseqs2 para el alineamiento de secuencias múltiples. Las estructuras se clasificaron mediante pLDDT y las estructuras mejor clasificadas se visualizaron con ChimeraX (UCSF).

La clonación de vectores de expresión y plásmidos de eliminación se realizó mediante técnicas de ensamblaje isotérmico estándar con salientes de 25 pb en cada fragmento (kit de ensamblaje de ADN HiFi, NEB). Los mutantes de V. cholerae se generaron mediante intercambio alélico como se describió anteriormente con el vector suicida pCVD442 que lleva brazos de homología de 500 a 700 pb en sentido ascendente y descendente del locus objetivo46,47. Se utilizaron SM10λpir o MFDλpir E. coli (un auxótrofo de DAP) como cepa donante con condiciones de conjugación idénticas, aparte de la suplementación con DAP. Se aislaron transconjugantes de cruce simple mediante placas selectivas sobre LB + estreptomicina/carbenicilina y se pasaron en sacarosa al 10% durante la noche a temperatura ambiente para seleccionar eventos de cruce doble. Las células se sembraron en placas con LB + estreptomicina, se volvieron a parchear en LB + estreptomicina y LB + estreptomicina/carbenicilina, y las colonias resistentes a estreptomicina y carbenicilina se examinaron mediante PCR de colonias para detectar una eliminación exitosa. Para las eliminaciones que involucran a vca0040, vca0040 siempre se eliminó en último lugar y se almacenaron y verificaron al menos dos clones por cepa para determinar el fenotipo correcto para proteger contra la formación espontánea de supresores. Para la expresión de vca0040 nativo del sitio cromosómico ectópico, se clonó la secuencia codificante completa junto con 350 pb aguas arriba para incluir el promotor nativo y se insertó en una ubicación genómica neutra conocida en V. cholerae48. Para la expresión de SAOUHSC_00846 del locus vca0040 en Δvca0040 V. cholerae, utilizamos el intercambio alélico para reemplazar la secuencia codificante de vca0040 con una secuencia SAOUHSC_00846 optimizada con codones para V. cholerae. Para el agotamiento de yghB de Δvca0040 V. cholerae, utilizamos pAM299, un vector suicida que reemplaza el alelo nativo del gen objetivo con una copia inducible por arabinosa49. Para los estudios de sobreexpresión, utilizamos pBAD18 para la inducción de arabinosa basada en plásmidos50.

S. aureus ΔSAOUHSC_00846 se generó con un intercambio alélico de un solo paso utilizando el plásmido pTarKO que lleva brazos de homología de 1000 pb aguas arriba y aguas abajo del locus objetivo que flanquea un casete de kanamicina como se describió anteriormente51. En resumen, el plásmido pTarKO ensamblado se electroporó en tarOoff electrocompetente de S. aureus RN4220 y se seleccionó para cruces dobles en TSB con kanamicina, neomicina y targocilo. Luego, la inserción de kanamicina en SAOUHSC_00846 se transdujo a S. aureus HG003 con el fago phi85. Se utilizó un protocolo idéntico para generar ΔSAOUHSC_02816. Para ΔSAOUHSC_0901, la cepa NE1150, que lleva una inserción de transposón marcada con resistencia a eritromicina en SAOUHSC_0090152, se utilizó como donante para la transducción en HG003. Para los estudios de sobreexpresión, utilizamos pLOW para la inducción de IPTG basada en plásmidos53. Los plásmidos ensamblados se electroporaron en RN4220 de tipo salvaje y se transdujeron a S. aureus HG003 ∆SAOUHSC_00846 con el fago phi85.

E. coli MC4100 y su derivado lptD4213 son sensibles a la arabinosa debido a la mutación araD139. Para permitir el uso del sistema de expresión de arabinosa pBAD, se aislaron mutantes espontáneos resistentes a arabinosa de MC4100 lptd4213 como se describió anteriormente54. En resumen, se sembraron cultivos nocturnos de E. coli lptD4213 (~10 µl) en placas LB + arabinosa al 0,4 % y se incubaron a 37 °C. Las supuestas colonias supresoras se purificaron en una nueva placa LB + arabinosa al 0,4%. Luego se analizó el crecimiento de las colonias supresoras en LB + arabinosa al 0,4% y ningún crecimiento en agar mínimo M9 + arabinosa al 0,2%, con el fin de seleccionar cepas que sean resistentes a la arabinosa, pero que no puedan usar arabinosa como fuente de carbono (es decir, ara −/r, pero no colonias ara+). Para transformar E. coli con varios vectores, las células competentes se sometieron a un choque térmico según un protocolo estándar y se seleccionaron en LB suplementado con los antibióticos apropiados.

Se construyeron mutantes RIMD2210633 de V. parahaemolyticus con un sistema de intercambio alélico similar al de V. cholerae como se describió anteriormente, con el vector suicida pDM440.

Para mediciones automatizadas de A600, se lavó una vez 1 ml de un cultivo de V. cholerae saturado a 37 °C durante la noche con 1 ml de medio nuevo (específico para el experimento) y se resuspendió en 1 ml de medio nuevo. Las bacterias resuspendidas se diluyeron hasta una dilución inicial de 1:4.000 realizando una dilución de 1:100 en 1 ml de medio fresco y una dilución posterior de 1:40 en 195 µl de medios específicos distribuidos en alícuotas en placas estériles de 96 pocillos (Corning). Se ejecutaron al menos tres réplicas técnicas por cepa y condición del medio por placa junto con al menos tres pocillos de medio en blanco. Las curvas de crecimiento se realizaron en un espectrofotómetro BioTek Epoch2 con agitación y se tomaron lecturas de A600 cada 10 min durante 20 a 24 h. Para la recolección de datos se utilizó Gen5 versión 3.08 (BioTek). Los datos para cada condición se promediaron entre réplicas técnicas y biológicas corregidas con los valores iniciales de A600 en blanco.

Las cepas de V. cholerae se cultivaron durante la noche a 37 °C en LB con la adición de 50 µg ml-1 de carbenicilina para las cepas con pBAD18. Los cultivos se diluyeron 1:100 en 5 ml de LB (complementado con 50 µg ml-1 de carbenicilina y arabinosa al 0,2 % para cepas con pBAD18) y se cultivaron a 37 °C hasta una DO600 de ~0,7. Las células se normalizaron a un A600 de 0,1 y luego se diluyeron en serie diez veces 6 veces. Se sembraron cinco microlitros de la serie de diluciones en agar LB Tris 100 mM, pH 9 (con 0,2% de arabinosa, 0,2% de glucosa o sin azúcar añadido) y se incubaron a 30 °C durante 18 a 24 h.

Las cepas de S. aureus se cultivaron durante la noche a 37 °C en TSB con la adición de 10 µg ml-1 de eritromicina para las cepas con pLOW. Los cultivos se diluyeron 1:100 en 5 ml de TSB (complementado con 10 µg ml-1 de eritromicina e IPTG 1 mM para cepas con pLOW) y se cultivaron a 37 °C hasta un A600 de ~0,7. Las células se normalizaron a un A600 de 0,1 y luego se diluyeron en serie diez veces 6 veces. Se sembraron cinco microlitros de la serie de diluciones en TSA Tris 100 mM, pH 9 (con o sin IPTG 1 mM) y se incubaron a 37 ° C durante 18 a 24 h.

Para obtener imágenes de células vivas en un solo momento, las muestras de los cultivos indicados se concentraron según fue necesario y se inmovilizaron en almohadillas de agarosa al 0,8% en PBS estéril en portaobjetos de vidrio (Gene Frames, Thermo) y se secaron antes de colocar el cubreobjetos. Para obtener imágenes de lapso de tiempo de células vivas, las muestras se colocaron en almohadillas de agarosa al 0,8% en LB estéril antes de obtener imágenes en una cámara con temperatura controlada a una velocidad de 1 fotograma por minuto durante 3 h de crecimiento. Se tomaron imágenes de las células con un microscopio Nikon Eclipse Ti equipado con una cámara Andor NeoZyla y un objetivo de apertura numérica (NA) de 100 × fase oleosa 3 utilizando el software NIS Elements AR versión 4.6 (Nikon). El análisis de imágenes se realizó con ImageJ versión 1.53. Las imágenes de las figuras manuscritas son representativas de al menos 10 campos de visión (FOV) de la misma muestra (>200 células) y múltiples cultivos replicados independientes como se indica.

Para inducir la formación de esferas, se retrodiluyeron cultivos de V. cholerae a 37 °C durante la noche (donde las células Δvca0040 todavía tienen en gran medida forma de bastón) 1:100 en el sobrenadante indicado o en medio fresco y se cultivaron durante 4 h agitando a 200 rpm a 30 °. C. Luego, se tomaron imágenes de las células como se describe anteriormente. Para el ensayo de tratamiento con d/l-Ala, los cultivos nocturnos se expandieron en LB fresco durante 90 minutos antes de agregar el aminoácido durante 1 h.

Para cuantificar las CIM de diversos agentes antimicrobianos, se diluyeron cultivos de V. cholerae a 37 °C durante la noche 1:100.000 en medios frescos. Se usaron cultivos diluidos para inocular placas de 96 pocillos que contenían 12 diluciones dobles del agente indicado en medio LB en una proporción de 50 µl de cultivo:50 µl de medio. Se realizaron cuatro réplicas técnicas por cepa y por dilución. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C y los valores de MIC se leyeron como la primera dilución donde no se observó turbidez. Para ensayos repetidos, las CIM se realizaron con cultivos independientes durante la noche.

Los cultivos nocturnos (a 37 °C) de S. aureus o E. coli se diluyeron a A600 = 0,01 y luego se diluyeron adicionalmente 1:100 en medio TSB nuevo. Los cultivos diluidos se añadieron a placas de 96 pocillos que contenían diluciones dobles del agente indicado en medio TSB o medio TSB Tris 5 mM, pH 8,5 en una proporción de 75 µl de cultivo:75 µl de medio. Las placas se incubaron durante 24 h a 30 °C (37 °C para E. coli) con agitación. Los valores de MIC se leyeron como la primera dilución en la que no se observó turbidez.

Para las CMI de sobreexpresión del vector E. coli lptD4213, los cultivos nocturnos se diluyeron 1:100 en LB no tamponado + carbenicilina + arabinosa al 0,2%. El cultivo creció durante 1,5 a 2 h y se diluyó a A600 = 0,01. Esto se diluyó adicionalmente hasta A600 = 0,0001 y se añadieron 75 µl del cultivo a 75 µl de dilución en serie del fármaco. Los cultivos diluidos se agregaron a placas de 96 pocillos que contenían diluciones dobles del agente indicado en LB Tris 5 mM, pH 8,5, CaCl2 1 mM, con 0,2 % de glucosa o 0,2 % de arabinosa en una proporción de 75 µl de cultivo: 75 µl de medio. . Las placas se incubaron y leyeron como se describe anteriormente.

Para V. cholerae, las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en LB + 200 µg ml-1 de estreptomicina. Para cada muestra, se recogieron 500 µl de cultivo nocturno y se centrifugaron a 5000 g durante 5 minutos, se lavaron una vez con 500 µl del medio correspondiente y se resuspendieron en 500 µl del medio correspondiente. Luego, este cultivo se añadió a 50 ml de medio M63 (pH 7 con NaCl 100 mM, pH 8 con NaCl 100 mM o pH 8 con NaCl 0 mM) suplementado con glucosa al 2% y 200 µg ml-1 de estreptomicina y se incubó a 30°. C durante aproximadamente 6 h hasta que la A600 alcanzó ~0,5. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos a 4 °C y se resuspendieron en 1,5 ml de PBS 1X. La resuspensión se añadió gota a gota en 1,5 ml de solución de SDS al 5 % en ebullición. La mezcla se hirvió durante 1 h y se agitó durante 2 h más después de apagar el fuego.

Para S. aureus, las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en 3 ml de TSB. Se agregaron 500 µl del cultivo nocturno a 100 ml de TSB sin ajuste de pH o TSB + bicina 100 mM pH 8,5 y se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 2 h hasta que el A600 alcanzó 0,5. Las células bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos a 4 °C y se resuspendieron en 1,5 ml de PBS 1X. Las muestras resuspendidas se hirvieron como para V. cholerae.

El peptidoglicano se extrajo de muestras hervidas como se describió anteriormente para bacterias Gram negativas y Gram positivas55. Una vez hervido, el material de la pared celular se granuló mediante ultracentrifugación y se lavó con agua. Los sáculos limpios se digirieron con muramidasa (100 μg ml-1) y los muropéptidos solubles se redujeron usando borato de sodio 0,5 M, pH 9,5 y 10 mg ml-1 de borohidruro de sodio. Luego se ajustó el pH de las muestras a 3,5 con ácido fosfórico. Los análisis UPLC se realizaron en un sistema Waters UPLC equipado con una columna ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm (Waters Corporation) y se identificaron mediante A204 nm. Los muropéptidos se separaron usando un gradiente lineal desde el tampón A (0,1% de ácido fórmico en agua) al tampón B (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo). La identificación de picos individuales se asignó mediante la comparación de los tiempos de retención y los perfiles con cromatogramas validados. La cantidad relativa de cada muropéptido se calculó dividiendo el área del pico de un muropéptido por el área total del cromatograma. La abundancia de peptidoglicano (peptidoglicano total) se evaluó normalizando el área total del cromatograma al A600. El grado de reticulación se calculó como se describió anteriormente56.

Para V. cholerae, las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en LB + 200 µg ml-1 de estreptomicina. Para cada muestra, se recogieron 500 µl de cultivo nocturno y se centrifugaron a 5000 g durante 5 minutos, se lavaron una vez con 500 µl del medio correspondiente y se resuspendieron en 500 µl del medio correspondiente. Luego se agregaron ochenta microlitros de esta resuspensión a 8 ml de medio M63 (pH 7 con NaCl 100 mM, pH 8 con NaCl 100 mM o pH 8 con NaCl 0 mM) suplementado con glucosa al 2 % y 200 µg ml-1 de estreptomicina y se incubaron. a 30 °C durante aproximadamente 6 h hasta que el A600 alcanzó ~0,5. Las células bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos a 4 °C, se lavaron dos veces con 1 ml de NaCl al 0,9 % enfriado con hielo y se resuspendieron en 200 µl de agua milliQ. La resuspensión se hirvió durante 30 min, se centrifugó a 20.000 g durante 15 min y el sobrenadante se filtró y analizó.

Para S. aureus, las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en 3 ml de TSB. Se agregaron ochenta microlitros del cultivo nocturno a 8 ml de TSB sin ajuste de pH o TSB + bicina 100 mM pH 8,5 y se incubaron a 37 °C durante ~2 h hasta que el A600 alcanzó ~0,5. Luego se procesaron los cultivos como para V. cholerae.

La cuantificación de los niveles de muropéptido UDP-M5 soluble mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de sobrenadantes filtrados se realizó como se describió anteriormente57. La detección y caracterización de muropéptidos solubles mediante LC-MS se realizó en un sistema UPLC interconectado con un espectrómetro de masas Xevo G2/XS Q-TOF (Waters Corporation) utilizando condiciones previamente informadas57. Los niveles de UDP-M5 se cuantificaron integrando las áreas de los picos de los cromatogramas de iones extraídos (EIC) del valor m/z correspondiente. La abundancia de UDP-M5 se normalizó para el cultivo A600 como para el peptidoglicano total.

Se cultivaron células de S. aureus o V. cholerae durante la noche a 37 °C en 10 ml de TSB o LB pH 7, respectivamente. Las células se lavaron, se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en el medio experimental (por ejemplo, TSB o LB a un pH determinado) y se inocularon a una dilución 1:200 en 200 ml del medio experimental. Una vez que se alcanzó un A600 de 0,6, las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se rompieron en una prensa francesa. Se descartaron los restos celulares y el sobrenadante se centrifugó en una ultracentrífuga Beckman Optima Max TL durante 15 minutos a 270.000 g. Luego se extrajeron los lípidos de los gránulos de membrana como se describe a continuación.

Los lípidos de membrana de S. aureus y V. cholerae se extrajeron en gran medida como se describió anteriormente58. Los sedimentos de membrana se resuspendieron en 500 µl de PBS. Luego se añadieron 1,25 ml de metanol y 625 µl de cloroformo. La suspensión se agitó durante 2 minutos a temperatura ambiente y los homogeneizados se centrifugaron a 7100 g durante 10 minutos a 4 °C. Se agregaron 625 µl de cloroformo y 625 µl de PBS a los sobrenadantes, se agitaron y se centrifugaron a 7100 g durante 10 minutos a 4 ° C para separar la fase de cloroformo de la fase de PBS-metanol. Luego se aisló la fase de cloroformo y se secó al vacío. Los sedimentos secos que contenían los lípidos de membrana purificados se resuspendieron en 300 µl de los disolventes de la fase móvil de UPLC (50 % de H2O con 0,1 % de ácido fórmico + 50 % de isopropanol con 0,1 % de ácido fórmico). Para garantizar que este método sea capaz de extraer C55-OH y C55-P, se agregaron 200 nmol de cada estándar lipídico (Larodan) a muestras de membrana purificadas frescas antes de someterlas al protocolo de extracción.

Los extractos de lípidos resuspendidos en disolventes de fase móvil UPLC se analizaron mediante UPLC en una columna C18 de fase inversa Columna UPLC Kinetex C18 Tamaño de partícula de 1,7 µm, tamaño de poro de 100 Å, 50 × 2,1 mm. La separación de los lípidos se logró usando un gradiente de H2O con ácido fórmico al 0,1 % para el disolvente A e isopropanol con ácido fórmico al 0,1 % para el disolvente B, un caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal durante 8 min, temperatura de la columna 60 ° C y una longitud de onda de 210 nm. La identificación de C55-OH y C55-P se basó en el tiempo de retención de los estándares y sus abundancias se calcularon en relación con el área total del pico de cada cromatograma. Para calcular las proporciones de mutantes y de tipo salvaje, se emparejaron aleatoriamente muestras de cultivos independientes cultivados el mismo día. Se utilizó el software de datos de cromatografía Empower3 (Waters) para la recopilación y el análisis de datos de UPLC.

Para sintetizar anfo-FL, se disolvieron 5 mg de anfomicina (Cayman Chemical) en 200 µl de dimetilformamida (DMF) y se combinaron con 7 µl de trietilamina. Por separado, se disolvieron 3 mg de fluoresceína-C5,6-NHS (Thermo Fisher, EE. UU.) en 200 µl de DMF y luego se agregaron a la solución de anfomicina. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 24 h. La solución se diluyó en un volumen igual de DMSO y se purificó mediante HPLC de fase inversa (Agilent 1260 Infinity) utilizando una columna de fase estacionaria C18 (Luna 5 µM C18(2) 100 Å, 250 x 10 mm). Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: fase A: agua (0,1% de ácido fórmico); fase B: acetonitrilo (0,1% de ácido fórmico). Fase B: 0-2 min, 50%; 2–15 min, gradiente lineal 50%–100%, 15–17 min, 100%. La longitud de onda del detector se fijó en 254 nm. El caudal fue de 4,7 ml min-1. La mezcla de productos de fluoresceína conjugada-C5,6 eluyó a los 9 min. Los eluatos de HPLC se recogieron en un matraz de fondo redondo de 50 ml, se concentraron mediante evaporación rotatoria, se transfirieron con DMSO a un tubo de microcentrífuga tarado y se liofilizaron, dando como resultado 1,7 mg de anfo-FL (M+1 = 1.649,23).

Para el etiquetado anfo-FL, se diluyeron cultivos nocturnos de S. aureus HG003 de tipo salvaje o ∆SAOUHSC_00846 1:100 en medio TSB fresco tamponado a pH 6 (MES 100 mM), 7 (Tris 100 mM) u 8,5 (bicina 100 mM). ). Los nuevos cultivos se cultivaron hasta A600 = 0,5. Se centrifugó 1 ml del cultivo a 1000 g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en 500 µl de solución salina tamponada con Tris (TBS) 1X, pH 9. Se transfirieron noventa y ocho microlitros de la mezcla a un tubo nuevo y se combinaron con 2 µl de 10 mg ml-1 de conjugado anfo-FL en DMSO. . La mezcla se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos, se lavó tres veces con 500 µl de 1X TBS pH 9 y se resuspendió en 100 µl de 1X TBS pH 9. Luego se añadieron diez microlitros de bacterias a una solución de agarosa al 0,8%. almohadilla en TBS pH 9 que contiene 1 μg ml-1 de yoduro de propidio y se muestran imágenes como se describe anteriormente. Para evitar sesgos en la selección de FOV, la almohadilla se escaneó con el canal FITC apagado para seleccionar FOV basándose únicamente en la densidad celular. Se tomaron imágenes de células bacterianas usando DIC con una exposición de 30 ms y la señal anfo-FL se capturó con el filtro FITC con una exposición de 1 s. La intensidad de fluorescencia de anfo-FL se cuantificó utilizando ImageJ versión 1.53. Los perfiles de señal FITC se generaron dibujando líneas de bisección a través de células en división, negativas para yoduro de propidio. La señal FITC se registró en el fondo a la izquierda de las celdas (A), en el pico de la pared izquierda (B), en las paredes intermedias (C), en el pico de la pared derecha (D) y en el fondo de la derecha de las celdas (E). La señal promedio se calculó mediante (B + C + D)/4 − (A + E)/2.

La generación de bibliotecas de transposones en los fondos Δvca0040 y ΔyghB se realizó como se describió anteriormente para HaitiWT V. cholerae15. Las cepas se conjugaron con SM10λpir E. coli que portaba el vector transposón donante pSC189. Debido al defecto de conjugación moderado de Δvca0040, utilizamos una concentración de 5 veces las reacciones de conjugación en comparación con las otras bibliotecas. Las reacciones se sembraron en placas de agar LB + estreptomicina/kanamicina de 245 mm2 para aislar los transconjugantes de V. cholerae y se incubaron durante la noche a 30 °C. Se generaron dos bibliotecas independientes Δvca0040 y ΔyghB, que constan de aproximadamente 200.000 colonias cada una y se almacenaron en un A600 de ~10 en LB + 25 % de glicerol. Para los análisis de secuenciación de inserción de transposones sintéticos, se descongeló una alícuota congelada de cada biblioteca y se utilizó para la extracción de ADN genómico con el kit Wizard (Promega). Las bibliotecas de ADN se prepararon de manera idéntica a los experimentos previos de secuenciación de inserción de transposones de nuestro grupo y se secuenciaron en una plataforma MiSeq interna (lllumina)18. Las lecturas se recortaron, mapearon y procesaron como se describió anteriormente con el proceso de análisis de secuenciación de inserción de transposones Con-ARTIST utilizando Python versión 3.0 y Matlab versión 918. Para identificar loci de interacción sintética, utilizamos el tipo salvaje como biblioteca de 'entrada' y el mutante como biblioteca de "salida" durante el análisis.

Para los análisis transcriptómicos, se retrodiluyeron cultivos nocturnos por triplicado de tipo salvaje y Δvca0040 V. cholerae a 37 °C 1:100 en medio LB fresco y se cultivaron a 30 °C durante 8 h con agitación. A las 8 h, las muestras se comprobaron mediante microscopía para garantizar el inicio de la formación de esferas en las muestras mutantes, momento en el que se centrifugaron 2 ml de cada cultivo (5 min a 5000 g a temperatura ambiente). El ARN se extrajo con reactivo Trizol (Sigma-Aldrich) según las instrucciones del fabricante. Luego, el ARN aislado se trató con ADNasa y se volvió a aislar con precipitación con etanol de acuerdo con un protocolo estándar. La calidad de las muestras de ARN se verificó con un bioanalizador para confirmar los valores de RIN> 6. La preparación de la biblioteca y la secuenciación fueron realizadas por el Centro de secuenciación del genoma microbiano (Pittsburgh). El análisis de secuenciación de ARN se realizó en gran medida como se describe59. Las lecturas se asignaron al genoma KW3 de V. cho\lerae (ensamblaje NCBI GCA_001318185.1) con Bowtie2 (versión 2.4.1)60. Luego se generó una matriz de lectura para cada muestra con featureCounts de Rsubread (versión 2.4.3)61. Luego se analizaron las matrices leídas con DESeq2 (versión 1.30.1) utilizando la configuración predeterminada en R (versión 4.0.3) para identificar genes expresados ​​diferencialmente. La reducción de datos se realizó con ashr62.

Para los análisis proteómicos, se cultivaron durante la noche cultivos de V. cholerae de tipo salvaje y ΔsecDF1 a 37 °C por triplicado durante la noche como se describe en 'Secuenciación de ARN'. A las 8 h de crecimiento, se prepararon muestras de sedimento de células enteras (WCP) centrifugando 1 ml de células durante 5 minutos a 5000 g a temperatura ambiente, lavándolas una vez en LB fresco, congeladas instantáneamente y mantenidas a -80 °C. El análisis de espectrometría de masas fue realizado por el Centro Thermo Fisher de Proteómica Multiplexada (TCMP) de la Facultad de Medicina de Harvard de acuerdo con protocolos estándar. Las muestras de WCP se sometieron a un flujo de trabajo de proteómica total con fraccionamiento. Las células granuladas se lisaron primero en urea 8 M, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinapropanosulfónico (EPPS) 200 mM y SDS al 1% con inhibidores de fosfatasa y proteasa. Luego, las muestras se redujeron con DTT y se alquilaron con yodoacetamida. Las proteínas alquiladas se precipitaron con metanol/cloroformo y se resuspendieron en EPPS 200 mM, pH 8, y se digirieron secuencialmente con LysC 1:50 y tripsina 1:100. Los péptidos se marcaron con reactivos TMT16, se combinaron y fraccionaron mediante un protocolo básico de fase inversa en 12 fracciones. Luego, las fracciones se secaron, se limpiaron en una punta de platina empaquetada con C18 y se eluyeron en un vial de muestra de espectrometría de masas para su análisis. Las muestras se resuspendieron en acetonitrilo al 5 %/ácido fórmico al 5 % y se analizaron mediante LC-MS3 en un espectrómetro de masas Orbitrap Lumos utilizando un método MS3 de 180 min. Los péptidos se detectaron (MS1) y se cuantificaron (MS3) en Orbitrap y se secuenciaron (MS2) en la trampa de iones. Se buscaron espectros de MS2 con el algoritmo COMET frente al proteoma KW3 de V. cholerae, su complemento invertido y contaminantes conocidos. Las coincidencias espectrales se filtraron a una tasa de descubrimiento falso del 1% utilizando la estrategia de señuelo objetivo combinada con un análisis discriminante lineal. Las proteínas se cuantificaron a partir de péptidos con un umbral sumado de señal a ruido de >150 y una especificidad de aislamiento de >0,5.

Para garantizar el aislamiento independiente de los supresores espontáneos, la cepa Δvca0040 se volvió a derivar 11 veces a partir de diferentes reacciones de conjugación. A partir de cada clon Δvca0040 verificado con defectos de forma celular y PCR, las colonias con morfología mutante (pequeñas y completamente azules) en placas LB + estreptomicina/X-gal se volvieron a rayar en nuevas placas LB + estreptomicina/X-gal y se cultivaron durante 36–48 h a 37 °C. Este proceso se repitió una vez. De las placas terciarias, se volvió a rayar una única colonia con morfología de tipo salvaje (grande con un halo blanco) para confirmar un fenotipo supresor estable. Los supresores se comprobaron mediante microscopía de cultivos nocturnos a 30 °C para confirmar la reversión del defecto de forma celular y se verificaron mediante PCR de colonias para confirmar la ausencia de vca0040 en su genoma. Los supresores validados se cultivaron durante la noche y se extrajo el ADN genómico como se describe anteriormente. La preparación y secuenciación de la biblioteca se realizaron internamente o se subcontrataron al Centro de secuenciación del genoma microbiano (Pittsburgh). Para la secuenciación interna del genoma completo, se etiquetó el ADNg y se le aplicaron códigos de barras con el kit de preparación de la biblioteca Nextera XT (Illumina), se verificó la calidad mediante BioAnalyzer y se secuenció en una plataforma MiSeq hasta al menos 20–50 × de profundidad del genoma de V. cholerae ( ~4 Mbps). El ensamblaje del genoma y la identificación de variantes se realizaron con CLC Genomics Workbench 12 (Qiagen, Alemania). Las variantes se filtraron frente a un aislado de HaitiWT ensamblado y resecuenciado con el mismo flujo de trabajo. Las mutaciones se asignaron como supresores si estaban presentes en> 90% de las lecturas y no ocurrieron en una región conocida con un mapeo deficiente o altamente repetitiva, como un locus de ARNt. Para la detección secundaria en bacterias secDF2-Δvca0040, la eliminación de Δvca0040 se volvió a derivar tres veces independientes en el fondo ΔsecD2 o ΔsecF2. Los supresores se aislaron y secuenciaron de manera idéntica a los del entorno parental Δvca0040.

Se cultivaron múltiples cultivos de 2 ml de S. aureus HG003 ∆SAOUHSC_00846 en TSB durante la noche a 37 °C. Luego se sembraron por separado ciento noventa microlitros de cada cultivo independiente durante la noche en placas TSA 100 mM Tris pH 9 (donde el mutante está completamente inhibido para el crecimiento) y se cultivaron a 37 °C durante 24 h. Los supresores se confirmaron volviendo a aplicar rayas en placas TSA Tris 100 mM, pH 9. Los supresores validados se cultivaron durante la noche y se extrajo el ADN genómico como se describe anteriormente. La preparación de la biblioteca, la secuenciación y la identificación de variantes se realizaron como se describió anteriormente para V. cholerae.

Las infecciones orales de conejos lactantes con V. cholerae se realizaron como se describió anteriormente15. Se alojaron conejos blancos de Nueva Zelanda de uno a dos días (Charles River Laboratories) con sus madres durante la duración del experimento en una instalación con temperatura y humedad controladas con ciclos de luz/oscuridad de 12 h (16–22 ° C, 50% de humedad). Los inóculos se prepararon centrifugando un cultivo de fase exponencial tardía (A600 0,6–0,8) de V. cholerae y resuspendiendo en bicarbonato de sodio al 2,5%. Para variar el pH de los inóculos, se ajustó el pH del bicarbonato de sodio a 9 o 7 con NaOH o HCl inmediatamente antes de la resuspensión. Los kits infectados se alimentaron por vía oral con 109 UFC de V. cholerae en un volumen de 500 μl, se devolvieron a su madre y se monitorearon durante 16 a 20 h después de la infección, cuando se sacrificaron mediante inhalación de isoflurano e inyección intracardíaca de 20 mEq de cloruro de potasio. . Los segmentos del intestino delgado y el ciego se aislaron mediante disección, se homogeneizaron mediante microesferas en PBS y las diluciones se sembraron en placas de agar apropiadas para la enumeración de colonias. Las placas se contaron después de una incubación durante la noche a 30 °C. Las mediciones de LOD se calcularon imputando una sola colonia en la dilución más baja (límite inferior) o más alta (límite superior) donde una colonia podría haberse identificado razonablemente, lo que significa que los valores de LOD son muestras donde el valor verdadero es como máximo (para el límite inferior). LOD) o al menos (para LOD de límite superior) el valor límite. Durante la disección del ciego, se utilizó una aguja de 28 G para extraer el líquido cecal crudo. Se tomó una muestra de líquido cecal crudo para placas de UFC y obtención de imágenes, y el resto se centrifugó a 21.000 g durante 2 minutos. El sedimento se descartó y los sobrenadantes se congelaron a -20 °C para análisis posteriores. Para los ensayos de incubación de líquido cecal, los cultivos nocturnos de V. cholerae se retrodiluyeron 1:100 en líquido cecal y se cultivaron durante 4 h a 30 °C con agitación antes de obtener imágenes.

S. aureus HG003 (tipo salvaje) y ΔSAOUHSC_00846 marcado con KanR se cultivaron durante la noche a 37 °C. Los cultivos se mezclaron en una proporción de 1:1, se combinaron 1:1 con 50% de glicerol y se almacenaron congelados a -80 °C en varias alícuotas. Para las infecciones, se descongeló una alícuota y se diluyó en PBS hasta una densidad de ~3 × 107 UFC ml-1. Se inyectaron cien microlitros en la vena de la cola de ratones hembra Swiss Webster de 8 a 9 semanas de edad. Los ratones fueron monitoreados diariamente y alojados en una instalación con temperatura y humedad controladas con ciclos de luz/oscuridad de 12 h (20–24 °C, 50% de humedad). En los días 2 y 5 después de la infección, los ratones se sacrificaron mediante inhalación de isoflurano y dislocación cervical y se recogieron el corazón, los pulmones, el riñón derecho, el hígado y el bazo. Los órganos se homogeneizaron con perlas de acero inoxidable en PBS y se sembraron en TSA y TSA + kanamicina (TSAK) y se incubaron durante la noche para enumerar las ΔSAOUHSC_00846 UFC totales, respectivamente. Los cálculos de LOD se realizaron como en experimentos con conejos infantiles.

Todo el trabajo con animales en este estudio se realizó de acuerdo con la Guía de los NIH sobre uso y cuidado de animales de laboratorio y con la aprobación del Brigham and Women's Hospital IACUC (protocolo n.° 2016N000334 para conejos lactantes y protocolo n.° 2016N000416 para ratones).

Las pruebas estadísticas utilizadas y la información replicada se indican en las leyendas de las figuras, en las secciones de métodos relevantes y en el resumen del informe. A menos que se indique lo contrario, los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes y se muestran resultados representativos o datos agregados (media ± sd). Los tamaños de muestra no estaban predeterminados estadísticamente. Los investigadores no estaban cegados a la identidad de la muestra durante todo el estudio, y la aleatorización de los animales en los experimentos de infección se realizó como se describe en el Resumen del informe. Todas las réplicas dieron resultados similares. Los análisis estadísticos se realizaron en Prism 9 (Graphpad) y Microsoft Excel 2020.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de la secuencia se depositaron en el Archivo de lectura de secuencias del NCBI con los códigos de acceso de BioProject PRJNA868324 (secuenciación del genoma supresor de V. cholerae), PRJNA868332 (secuenciación de ARN de V. cholerae), PRJNA877769 (secuenciación de inserción de transposones de V. cholerae) y PRJNA877773 (supresor de S. aureus) secuenciación del genoma). Los datos de proteómica se depositaron en MassIVE con el código de acceso MSV000090217. Todos los demás datos están disponibles gratuitamente y sin restricciones a través de los autores correspondientes previa solicitud. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01AI-042347 a MKW y F31AI156949 a KH), el Instituto Médico Howard Hughes (MKW), el Consejo Nacional de Investigación en Ciencias e Ingeniería de Canadá (PGSD3-487259-2016 a BS), Investigación Sueca Council (FC), Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse (FC), Laboratorio de Medicina de Infecciones Moleculares de Suecia (FC) y Fundación Kempe (FC) Agradecemos a C. Wegler del laboratorio de Cava por la asistencia técnica con el análisis de C55-P; miembros del laboratorio Waldor por sus comentarios y discusiones durante el estudio; D. Rudner por coordinar la presentación; el Centro Científico Thermo Fisher de Proteómica Multiplexada de la Facultad de Medicina de Harvard, especialmente R. Rodrigues, por su ayuda con la proteómica; y el Centro de secuenciación del genoma microbiano (MiGS) para obtener asistencia con la secuenciación de ARN y la secuenciación del genoma completo. Esquemas y figuras modelo en las Figs. 1, 3 y 5 y datos ampliados Figs. 5, 7 y 9 fueron generados con BioRender.com. Este artículo está sujeto a la política de Acceso Abierto a Publicaciones del HHMI. Los jefes de laboratorio del HHMI han otorgado previamente una licencia CC BY 4.0 no exclusiva al público y una licencia sublicenciable al HHMI en sus artículos de investigación. De conformidad con esas licencias, el manuscrito de este artículo aceptado por el autor puede estar disponible gratuitamente bajo una licencia CC BY 4.0 inmediatamente después de su publicación.

Brandon Siéntate

Dirección actual: Departamento de Biología, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Veerasak Srisuknimit

Dirección actual: Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia

Estos autores contribuyeron igualmente: Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Emilio Bueno

División de Enfermedades Infecciosas, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, EE. UU.

Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Franz G. Zingl, Karthik Hullahalli y Matthew K. Waldor

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Franz G. Zingl, Karthik Hullahalli y Matthew K. Waldor

Laboratorio de Medicina de Infecciones Moleculares de Suecia (MIMS), Departamento de Biología Molecular, Centro de Investigación Microbiana de Umeå (UCMR), Universidad de Umeå, Umeå, Suecia

Emily Bueno y Philip Cava

Departamento de Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Escuela de Salud Pública TH Chan de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Mateo K. Waldor

Instituto Médico Howard Hughes, Bethesda, MD, EE. UU.

Mateo K. Waldor

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BS, VS y MKW concibieron el estudio. BS, VS y EB diseñaron experimentos con la supervisión de FC y MKWBS y realizaron experimentos in vitro e in vivo con V. cholerae, así como análisis bioinformáticos y visualización de datos. VS realizó experimentos in vitro con S. aureus, experimentos con E. coli lptd4213 y sintetizó anfo-FL. EB realizó extracción y cuantificación bioquímica de peptidoglicano y C55-P. FGZ realizó experimentos in vitro y ayudó en la replicación de datos. KH identificó supresores espontáneos de V. cholerae, realizó el experimento in vivo de S. aureus y ayudó en la replicación de datos. Todos los autores participaron en el análisis e interpretación de los datos. BS y MKW escribieron el manuscrito con aportaciones y ediciones de todos los demás autores.

Correspondencia a Felipe Cava o Matthew K. Waldor.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Carol Gross, Anant Menon y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a): datos de secuenciación de inserción de transposones en conejos infantiles reproducidos de Hubbard et al. (ref. 15) identificando vca0040 (rojo) como un determinante de la colonización intestinal de V. cholerae. El operón tcp, conocido por ser crítico para la colonización, está resaltado en azul. Se muestra un conejo representativo (#403). Los valores de p inversos se obtuvieron mediante la prueba U de Mann-Whitney sin ajustes para comparaciones múltiples. Los umbrales trazados son los mismos que los de la Fig. 4a. (byc): estructura de dominio, etiquetas de locus, números de acceso (b) y alineación (c) de proteínas que contienen V. cholerae y S. aureus DUF368. La alineación se realizó con T-COFFEE. IN: secuencia prevista de cara al citosol. HEL: secuencia de hélice transmembrana prevista. FUERA: secuencia prevista de orientación hacia el exterior. (d y e): Conservación filogenética de los dominios DUF368 (PF04018). (d): Conservación a nivel familiar (líneas azules) agrupadas por filo (arcos de colores). Los filos seleccionados y bien representados están etiquetados. Las líneas azules no están escaladas y no proporcionan información sobre el número o la diversidad de secuencias DUF368 dentro de la familia. (e): Desglose a nivel familiar de la conservación DUF368.

Las proteínas que contienen DUF368 de V. cholerae (izquierda) y S. aureus (derecha) se modelaron utilizando AlphaFold2 y se visualizaron con ChimeraX. (a): Cobertura de alineación de secuencias múltiples (MSA) (izquierda) y pLDDT (puntuación de confianza, derecha) por posición para cada proteína de AlphaFold2. (b): estructuras generales de la cinta, coloreadas desde los extremos N (violeta) a C (rojo). (c y d): mapas de potencial de superficie electrostático (c) y lipofilicidad (d) generados utilizando la configuración predeterminada de ChimeraX. Los paneles de V. cholerae se reproducen a partir de la Fig. 1c,d para mayor claridad. Escala de colores electrostática: -10 a 10 kcal/(mol·e). Barra de color de lipofilicidad: lipofilicidad molecular relativa calculada por ChimeraX. (e): cobertura de MSA, gráfico de pLDDT y vistas de la superficie electrostática y de cinta de la proteína DUF368 de Haloferax volcanii (HVO_RS12060).

(a): evolución del tiempo de siembra en UFC de WT y Δvca0040 V. cholerae. El inicio de la fase estacionaria ocurre después de 6 h. (b): imágenes de contraste de fase de WT, Δvca0040 y Δvca0040 + vca0040 V. cholerae en cultivos nocturnos en las condiciones indicadas. (c): evolución temporal de las imágenes de contraste de fase de las cepas indicadas cultivadas en LB a 30 °C durante el período de tiempo indicado. (d): Imágenes de lapso de tiempo de células Δvca0040 inmovilizadas en una almohadilla de agarosa a partir de un cultivo nocturno a 30 °C. Las imágenes se adquirieron durante 3 h de crecimiento. (e): Imágenes de V. cholerae tratadas con sobrenadante gastado libre de células normal, hervido (10 min) o filtrado (<3K MW límite) durante 4 h a 30 °C. (f): Imágenes de V. cholerae tratada con vehículo (DMSO) o 3 mM de D- o L-Ala en LB fresco durante 4 h a 30 °C. a: media ± DE de n = 3 cultivos independientes por cepa. b, c, e, f: imágenes representativas de n = 3 cultivos independientes por cepa/condición. d: lapso de tiempo representativo de una sola célula representativa de >20 bacterias con forma de esfera en n = 3 campos de visión separados de un único cultivo nocturno. Barras de escala: 3 (b,c,f) o 5 (d,e) µm.

(a y b): crecimiento alcalino de Δvca0040 V. cholerae que porta vectores pBAD18 que expresan (a) SAOUHSC_00846 de S. aureus o (b) HVO_RS12060 de H. volcanii. (ce): Análisis de composición y reticulación en las cepas de V. cholerae indicadas al pH indicado en medio M63. Supresor: Δvca0040/ΔsecDF1. (f y g): Igual que ce para S. aureus cultivado en las condiciones indicadas. a, b: datos representativos de n = 3 cultivos por cepa/condición. cg: media ± DE de n = 3 cultivos por cepa/condición. El análisis estadístico se realizó con ANOVA unidireccional con pruebas de comparación múltiple de Tukey (ce) o pruebas t de Student de dos colas no apareadas (f, g).

(anuncio): RNAseq de Δvca0040 V. cholerae, con esquema (a), confirmación de la formación de esferas mediante imágenes en la recolección de muestras (b), análisis de componentes principales de los datos de RNAseq (c) y diagrama MA de las secuencias analizadas (d) ( n = 3 cultivos independientes por cepa). Se implementó un límite de cambio de pliegue arbitrario (FC) de 4 durante el análisis de RNAseq, y los genes con valores de FC por debajo del umbral del valor p de 0,05 se resaltan en rojo. pgpB y vca0040 están etiquetados. (e y f): trazas de UPLC (e) y cuantificación de la abundancia relativa de C55-P (f) en V. cholerae cultivado al pH indicado. (g): S. aureus teñido con Ampho-FL cultivado a pH 6, 7 u 8,5. (h): Cuantificación de la señal de tinción anfo-FL a diferentes pH como se muestra en g. Los símbolos representan la intensidad media de anfo-FL de n = 1 a 8 grupos bacterianos individuales en cultivos independientes. Se utilizaron cultivos únicos de pH 8,5 como controles, ya que para este experimento se utilizó un nuevo lote de anfo-FL. e, g: datos representativos de n = 3 cultivos por cepa/condición (excepto n = 1 cultivo en pH 8,5 en g). f, h: n = 3 culturas independientes. El análisis estadístico se realizó con (d) pruebas de Wald en el proceso DESeq2 con múltiples ajustes de comparación o (f, h) pruebas t de Student de dos colas no apareadas. Barras de escala, 5 µm.

(a): pantalla de inserción de transposones sintéticos en ΔyghB V. cholerae. Los valores de p se obtuvieron mediante la prueba U de Mann-Whitney (MWU) sin ajuste para comparaciones múltiples. MFC: cambio medio en la cobertura de lectura entre ΔyghB y WT. (b): Crecimiento de Δvca0040 V. cholerae que expresa vectores con genes inducibles por arabinosa en placas LB regulares (izquierda), LB pH 9 (centro) y LB pH 9 + arabinosa (derecha). (c): Crecimiento de V. cholerae que carece de uno o ambos de vca0040 y/o yghB en placas LB pH 6. LB se tamponó con MES 100 mM y se ajustó el pH con HCl. a: datos agrupados de n = 2 bibliotecas de transposones independientes. b, c: imágenes representativas de n = 3 cultivos por cepa/condición.

(a): Colonias representativas de WT, Δvca0040 y supresor V. cholerae en placas LB+X-gal. Las flechas blancas indican supresores. (b): mutaciones supresoras espontáneas de Δvca0040 V. cholerae. SecD1, SecF1 y PpiD son parte de la maquinaria de secreción de proteínas de V. cholerae. El texto en color indica supresores de una pantalla secundaria en ΔsecD2/Δvca0040 (azul) o ΔsecF2Δvca0040 (rojo) V. cholerae. Asterisco: codón de parada. (c): Imágenes de contraste de fase de cultivos LB a 30 °C durante la noche de las cepas indicadas en el fondo Δvca0040. Barras de escala, 3 μm. (d): pH del cultivo LB a 30 °C durante la noche de las cepas indicadas. (e): Funciones SecDF1 y SecDF2 en V. cholerae. Posibles funciones de SecDF: acoplamiento de la importación de iones a la estimulación de SecA ATPasa (flecha inferior) o guía del sustrato Sec hacia el periplasma (flecha superior). (f): letalidad sintética de secD2 en ΔsecD1 V. cholerae utilizando el vector suicida pAM299 para la expresión de secD2 dependiente de Ara. (g): Crecimiento de las cepas indicadas en medio M63 con NaCl o KCl añadidos. (h): diagrama de cascada que compara ΔsecDF1 con el proteoma WT V. cholerae clasificado por cambio de pliegue de proteína (FC). (i): Crecimiento de Δvca0040 V. cholerae en medios M63 que varían [Na+] (arriba) o [K+] (abajo) a pH 6, 7 u 8. (j y k): Crecimiento de WT (j) o Δvca0040 (k) V. cholerae en M63 pH 8 con un rango de [NaCl]. Las curvas de NaCl 100 mM de i se replican en j y k para comparar. (l y m): Crecimiento de las cepas de V. cholerae indicadas en LB no tamponado (l) o pH 6 (m) con NaCl regular (~170 mM) o sin NaCl añadido. a: imagen representativa de n = 11 cepas supresoras independientes. c, f, l, m: datos representativos de n = 3 cultivos por cepa/condición. d: media ± DE de n = 3 cultivos por cepa. g, i, j, k: media ± DE de al menos 3 réplicas técnicas de cultivos individuales (representantes de n = 3 cultivos por cepa/condición). h: datos agrupados que comparan n = 4 cultivos independientes de cada cepa.

(a): UFC total en infecciones mixtas con diferente pH del inóculo (n = 6 cada uno para pH 7 y 9). (b): índice de acumulación de líquido (FAR) en infecciones mixtas con diferente pH del inóculo. (c): Placas representativas de UFC del intestino delgado de infecciones únicas que muestran la transmisión de WT V. cholerae (colonias translúcidas grisáceas) de conejos infectados con WT a conejos infectados con Δvca0040 en la misma camada. Tenga en cuenta que las colonias Δvca0040 (flechas blancas) son más claras y más pequeñas que las colonias WT, lo que las hace visualmente distinguibles y contables. (d): imágenes directas de GFP+ V. cholerae en muestras de FQ de infección única. Es probable que las grandes esferas brillantes de GFP sean células Δvca0040 en presencia de células WT transmitidas en forma de bastón. Barras de escala, 3 μm. a: medias geométricas analizadas con pruebas U de Mann-Whitney de dos colas. b: media ± DE analizada con la prueba t de Student de dos colas no apareada. c, d: imágenes representativas de n = 3 WT y n = 7 Δvca0040 conejos infectados individualmente.

Datos fuente

(a): esquema de infecciones intravenosas y flujo de trabajo de recolección de muestras. Los recuentos de TSA indican la carga total de UFC de S. aureus, mientras que los recuentos de TSAK indican la carga de ΔSAOUHSC_00846. Se utilizaron N = 5 ratones por punto temporal (n = 10 en total). (b): Recuentos de UFC sin procesar de placas TSA y TSA + kanamicina (TSAK). En ausencia de un defecto competitivo, los recuentos de TSAK deben ser el 50% de los de las placas TSA (y, por lo tanto, están muy juntos en el gráfico trazado con log10). (c): Relación de unidades formadoras de colonias (UFC) ΔSAOUHSC_00846 (KanR) respecto del total de UFC de S. aureus en el día 2 (izquierda) y el día 5 (derecha) después de la infección. La línea de puntos indica la proporción inicial media de n = 2 placas técnicas replicadas del inóculo. Los círculos abiertos representan el límite de detección (LOD). Tenga en cuenta que no se representaron gráficamente las muestras con recuentos de UFC por debajo del LOD. b: medias geométricas. c: media ± DE.

Datos fuente

(a): Diagrama de Venn de resultados a nivel de especie de Annotree para consultas PFAM PF04018 (DUF368), PF09335 (DedA) y PF02673 (BacA/UppP). De las 30.255 especies bacterianas de la base de datos Annotree, se prevé que 29.416 (97,2%) contengan al menos una de las tres proteínas. En la Tabla complementaria 9 se incluye una lista de especies en cada segmento del diagrama de Venn. Es probable que esto también sea una sobreestimación del número de especies que carecen de cualquiera de estos tres dominios debido a la divergencia de secuencia y a una anotación PFAM potencialmente inadecuada. Por ejemplo, el patógeno intracelular obligado Rickettsia rickettsii (GCA_000018225.1) está en el grupo triplemente ausente, pero tras la curación manual se sabe que tiene peptidoglicano y una secuencia codificante DedA anotada, lo que quizás refleja un retraso en la anotación de PFAM. Curiosamente, sin embargo, las especies de Mycoplasma, que no tienen lipopolisacáridos ni peptidoglicanos (y por lo tanto pueden no depender de la translocación de C55-P) parecen estar realmente triplemente ausentes, excepto por unos pocos miembros seleccionados que solo contienen una proteína que contiene DUF368. (b): Crecimiento de V. parahaemolyticus que carece de la proteína VPA1624 que contiene DUF368 a pH neutro y ácido. VPA1624 interactúa genéticamente con los loci secDF1 de V. parahaemolyticus, ya que la eliminación de estos supresores identificados originalmente en V. cholerae rescata la cepa agotada de vpa1624. Ara: arabinosa, Glc: glucosa. Datos representativos de n = 3 cultivos independientes por cepa/condición.

Clados bacterianos y arqueales con proteínas que contienen PF04018. Annotree se utilizó para trazar e identificar especies con un dominio DUF368 anotado. Cada pestaña de la hoja de cálculo es un nivel diferente de clasificación bacteriana (Filo>Orden>Familia>Género>Especie). Los clados de Archaea se combinan en la pestaña "Archaea".

Homólogos de VCA0040 en bacterias. Se utilizó HMMER para identificar secuencias homólogas a VCA0040 en la base de datos Uniprot. Cada especie se enumera una vez.

Arquitecturas de dominio notables de proteínas que contienen DUF368 y DedA. Las secuencias se obtuvieron buscando en InterProScan con las designaciones de familia PF para DUF368 (PF04018) y DedA (PF09335).

RNAseq de Δvca0040 V. cholerae durante la formación de esferas. Para los 40 genes regulados positivamente en Δvca0040, se realizó la curación manual de la localización subcelular con SignalP y pSortb. Los valores de p se obtuvieron mediante la prueba de Wald realizada por DESeq2 con ajustes para comparaciones múltiples.

Datos de CMI para V. cholerae, S. aureus y E. coli. Los datos de cada organismo se separan en hojas de trabajo individuales. Tenga en cuenta que los datos de S. aureus se dividen en dos hojas de trabajo, una para la caracterización WT versus Δ0846 (“SA”) y otra para WT versus Δ0846, Δ2816 y Δ0901 (“SA_dedA”). Todos los datos de V. cholerae están bajo “VC” y todos los datos de E. coli lptd4213 están bajo “EC_lptd4213”.

Detección de inserción de transposones sintéticos en Δvca0040 V. cholerae. Tenga en cuenta que no se analizaron las regiones intergénicas (IG_) y las regiones con <5 sitios informativos (posibles sitios de inserción de transposones). Los accesos a la segunda pestaña se establecieron como umbral en un valor p de MWU inverso >100 antes de ordenar por el cambio medio de log2.

Detección de inserción de transposones sintéticos en ΔyghB V. cholerae. Tenga en cuenta que este conjunto de datos no se ha filtrado como en la Tabla complementaria 6.

Proteómica comparativa multiplexada de WT de células completas y ΔsecDF1 V. cholerae. El cambio en veces se calculó dividiendo la abundancia relativa normalizada promedio de proteínas en ΔsecDF1 por la de WT.

Conservación de PF04018, PF09335 y PF02763 en especies bacterianas. La hoja de cálculo fue generada por consultas de Annotree para todas las combinaciones posibles de las tres familias de proteínas. La hoja "Maestra" enumera todos los organismos a nivel de especie con la combinación de dominios indicada. La hoja "Especies modelo" enumera microorganismos seleccionados de particular interés y se puede utilizar para buscar cualquier especie determinada en la tabla de referencia. BLAST debe confirmar manualmente la presencia o ausencia de especies de interés para evitar problemas de anotación errónea o falta de anotación.

Cepas, vectores e información genómica utilizados en este estudio. Cualquier cepa o vector enumerado se puede solicitar al contacto principal ([email protected]).

Diccionario BLAST para la asignación de nombres putativos de VC a los loci de HaitiWT V. cholerae. Todas las secuencias codificantes de HaitiWT se utilizaron como consultas en un lote BLAST del proteoma N16961 de V. cholerae. Se seleccionó el mayor resultado por valor electrónico y se asignó automáticamente el nombre de VC. Sin embargo, como BLAST por lotes genera un resultado independientemente de la confianza, aún se requiere la curación manual para loci específicos cuando se utiliza este diccionario.

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Reimpresiones y permisos

Siéntese, B., Srisuknimit, V., Bueno, E. et al. Las translocasas de undecaprenil fosfato confieren aptitud microbiana condicional. Naturaleza 613, 721–728 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05569-1

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Recibido: 02 de marzo de 2022

Aceptado: 17 de noviembre de 2022

Publicado: 30 de noviembre de 2022

Fecha de emisión: 26 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05569-1

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